替代方法的使用策略

所谓的“替代方法”是对英文“alternative methods”的翻译，但其意义应该是指“最优选的方法”，而不仅仅是追求“替代”动物试验。研究“化妆品动物体外替代试验”是为了寻找更精确、一致性更高、更灵敏、更经济的优选方法，而这些“优选方法”首先需要符合3R原则。

纵观替代毒理学的发展，其研发思路经历了最开始的以离体器官、屠宰场废料、鸡胚等取代整体动物试验，至以体外细胞系、重建人体组织（眼角膜、皮肤模型）为研究对象的模型，再到以微生理为基础的芯片技术，以及以计算及信息技术为基础的定量构效关系（QSAR）预测等。

在安全性评价中，经过验证的用于评价局部毒性的替代试验方法较多，包括皮肤刺激性/腐蚀性、眼刺激性/腐蚀性、皮肤光毒性、皮肤致敏性等，可通过单一方法或几种替代方法组合的策略，评价化妆品及其配方原料（包括杂质）的安全性，且在评价过程中不使用整体动物试验。但是在全身毒性方面（遗传毒性、致癌性/致畸性/致突变性、胚胎毒性等），至今没有可以完全取代动物试验的策略，尤其是在亚慢性和长期毒性的评估中，仍然依赖整体动物试验。

根据替代方法的研究和使用经验，科学界逐步形成了根据特定的毒理学终点，“自上而下”或“自下而上”地有序选择一系列试验的“组合策略”。例如评价一个受试物的眼刺激性时，可以从评价腐蚀性的试验开始，到评价刺激性的试验结束，或反过来检测。组合策略既可以高效地筛选出结果，也可以弥补单一试验的局限性。

风险评估是以保证消费者健康安全为目的、识别和控制化妆品安全风险的手段，通过定量或定性的方法，在特定情境下衡量危害或者预估风险的大小和程度。风险评估可分为定性评估和定量评估。定性评估结论常常以“是”或“否”、“低”“中”或“高”来表示目标物质的毒理学性质；定量评估是通过试验数据进行计算来表示风险大小，化妆品安全风险评估中常根据透皮吸收进入循环系统的量来计算安全边界值（MoS）。

在进行风险评估时，需要考虑任何现有并且可靠的科学数据。除化合物已有的理化性质、动物试验数据、体外试验数据、临床研究、使用中的不良反应信息外，还可以加入计算机模拟预测的数据，如定量构效关系（QSAR）、生理基础的药物动力学/毒代动力学模型数据（PBPK/PBTK）、物质分组（grouping）及交叉参照法（read-across），这些计算机模拟预测的数据为化妆品原料的前期开发提供了新的研究思路和方向，作为模拟预测的结果可为安全风险评估提供背景数据，但并不是毒理学证据。在欧盟推出REACH法规以及化妆品动物试验禁令后，替代方法在安全风险评估中的作用日益重要。

美国的“21世纪毒性试验：远景与策略”指出，未来的毒性测试和风险评估策略应以“毒性通路”为基础，通过计算生物学方法和以人类生物学为基础的体外方法组合，对毒性通路中有显著生物学意义的影响进行评估，目标是在危害发生早期及时识别关键路径中受到影响而导致不良健康结局的因素，了解其对人体健康产生的影响。

2001年，国际化学品安全规划处（IPCS）提出以毒性作用模式（Mode-of-Action，MOA）确定动物数据与人类的相关性。此后，学术界又提出了“有害结局路径”（Adverse Outcome Pathway，AOP）概念，用于描述分子起始事件（Molecular Initiating Event，MIE）在生物体不同组织结构层次中所表现出的与危害评估相关“有害结局”（Adverse Outcome，AO）间的相互联系。AOP将现有方法与系统生物学联系起来，收集和评估与化学、生物学和毒理学相关信息，为化学物毒性预测和法规决策提供科学依据。

AOP的概念与传统的毒性作用评价不同，它整合了与毒性测试终点相关信息或因果联系，即关键事件关系（Key Event Relationships，KER），通过阐释与有害结局相关的通路机制，建立与法规监测相关的毒性终点及相应测试方法。因此，AOP可以有效整合多学科的最新技术，发掘毒性作用下更深层次的作用机理，开发新型的基于人体生命科学的测试方法，进行化学物危害评估或提供优先级测试建议，实现3R目标。近几年兴起的皮肤致敏性替代方法，就是成功应用AOP的案例。

具体来说，皮肤致敏分为致敏阶段和免疫应答阶段，在皮肤致敏的AOP中共包含4个关键事件（Key Event，KE）：KE1（也是MIE）为外源性化学物质与皮肤蛋白共价结合形成复合物（抗原），引起细胞层面的KE2角质细胞应答（炎症反应）和KE3树突状细胞激活；活化的树突状细胞迁移至淋巴结导致器官/系统性反应（Organ/System response）的KE4记忆T细胞的增殖，人体再次接触同类抗原时引起免疫应答；最终在机体层面（Organism response）的有害结局（AO）引起人体的接触性皮炎。针对皮肤致敏性AOP过程中的每一个关键事件，设计相应试验进行检测，以不同KE阶段的试验结果为参考，综合性评价化学物质的皮肤致敏性。需要关注的是，由于每种试验都有其局限性，且皮肤致敏性的有害结局产生是一系列KE连续发生的过程，所以不同阶段的检测结果需根据证据权重综合考虑。

（摘自《化妆品安全性评价方法及实例》　王钢力、邢书霞主编　中国医药科技出版社出版）